簡(jiǎn)介：

維生素B₁₂又叫鈷胺素，是維一含金屬元素的維生素。自然界中的維生素B₁₂都是微生物合成的，高等動(dòng)植物不能制造維生素B₁₂。維生素B₁₂是維一的一種需要一種腸道分泌物（內(nèi)源因子）幫助才能被吸收的維生素。有的人由于腸胃異常，缺乏這種內(nèi)源因子，即使膳食中來(lái)源充足也會(huì)患惡性貧血。植物性食物中基本上沒(méi)有維生素B₁₂。它在腸道內(nèi)停留時(shí)間長(zhǎng)，大約需要三小時(shí)（大多數(shù)水溶性維生素只需要幾秒鐘）才能被吸收。維生素B₁₂的主要生理功能是參與制造骨髓紅細(xì)胞，防止惡性貧血；防止大腦神經(jīng)受到破壞。

原理：

CLOVER VB12試劑盒的測(cè)定是基于免疫學(xué)中抗原抗體特異性反應(yīng)的原理而建立的。微孔板包被有VB₁₂抗原。加入VB₁₂抗體和VB₁₂標(biāo)準(zhǔn)品或樣品提取液。標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中提取的VB₁₂能與酶標(biāo)板上的VB₁₂包被原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合定量的抗體，沒(méi)有結(jié)合的抗體、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中提取的VB₁₂在洗滌步驟中被除去。再加入酶標(biāo)二抗與微孔中的VB₁₂抗體反應(yīng)。洗滌除去沒(méi)有反應(yīng)的酶標(biāo)二抗。加入底物溶液溫育，酶標(biāo)記物將無(wú)色的顯色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物，加入終止液后顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在450nm 處測(cè)量每孔的OD值。OD值與樣品中的維生素B₁₂含量成反比。

奶粉前處理:

1)         稱取1.0g奶粉樣品于50mL離心管中，加入9mL 50℃純凈水溶解，即位復(fù)原乳樣品。

2)         取1mL復(fù)原乳樣品到1mL離心管中，4℃ 3000r/min離心10分鐘。

3)         去除上層脂肪層，轉(zhuǎn)移出100μL中層奶液至一潔凈的離心管中，加入稀釋緩沖液500μL，渦旋混勻待檢（1 份上層液＋5份稀釋液）。

4)         取50μL 進(jìn)行分析。

試劑盒操作：

1)         取所需量的微孔板條裝在酶標(biāo)板框架上。

2)         分別吸取50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，再各加入50μL的抗體，加蓋，室溫（25℃）溫育30分鐘。

3)         倒出孔中的液體，每孔加入250μL稀釋好的洗滌液洗滌，重復(fù)操作四次。

4)         每孔加入酶標(biāo)二抗100μL， 室溫（25℃）溫育30分鐘。

5)         重復(fù)步驟3，反復(fù)洗滌四次。

6)         每孔加入100μL顯色底物，室溫避光溫育10分鐘。

7)         每孔加入50μL終止液，混勻。

置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）

注意事項(xiàng)

1)         室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。

2)         在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3)         標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。

4)         混合要均勻，洗板要徹低（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。

5)         終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。

6)         不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要使用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定誤差。